【针灸论著】针刺后海穴对自闭症模型大鼠大脑皮质M1和海马CA1区PSD-95蛋白表达的影响 《长沙自闭症》
3.1 PSD-95作为支架蛋白，属于膜结合鸟苷酸激酶蛋白家族，主要位于谷氨酸突触的突触后致密区，在谷氨酸受体的信号转导和整合中起关键作用作者简介:张学军(1981—)，男，讲师，主要从事针灸治疗小儿脑病的研究。。可以在表达截短的PSD-95突变体的小鼠中观察到，其结合NMDA受体的能力丧失。PSD-95在功能上与突触可塑性的改变密切相关。颗粒阳性标记物可以通过免疫组织化学技术检测出来，比如突触可塑性的变化，PSD-95表达的颗粒阳性标记物也会随之变化。本实验通过免疫组织化学技术检测和分析PSD-95蛋白颗粒的表达，可以分析PSD-95表达的变化，间接反映突触的可塑性穴位可增加自闭症模型大鼠大脑皮质M1区和海马CA1区PSD-95蛋白的表达。既往研究表明针刺后海穴可以提高自闭症模型大鼠的学习记忆能力，其机制可能与针刺对突触可塑性的影响有关。神经元的突触可塑性包括功能可塑性和结构可塑性两部分，与学习记忆密切相关1.3.2针刺治疗大鼠生后第23天，针刺组和非针刺组采用一次性不锈钢毫针，直刺后海穴和非针刺穴0.3寸，补泻手法1分钟后拔针，连续治疗10天为1个疗程，间隔2天为1个疗程，共3个疗程。非穴组选取大鼠右侧非经非穴，其余操作同针刺组。空白组和模型组在相同条件下饲养，不进行任何干预。。针刺后海穴可促进自闭症模型大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)的分泌注:与空白组比较，1)P < 0.05；与模型组比较，2) P < 0.05。分钟。TRB由BDNF介导，PSD-95和TRB在体内相互作用。所以BDNF -Trk B通路的激活使得PSD -95从细细胞聚集到突接触，这是突接触可塑性的关键。针刺后海穴增加BDNF分泌，从而激活BDNF介导的Trk B受体，被激活的Trk B发出信号通知PSD-95通过PI3K-Akt募集突触，从而影响自闭症模型大鼠脑内突触可塑性，提高学习记忆能力。非穴位刺激对自闭症模型大鼠M1皮层和海马CA1区PSD-95蛋白表达的影响。虽然处于非穴位位置，但属于经络系统的范畴。非穴位刺激是否有效果，还是本研究样本量太小，有待进一步观察。。3.2本实验中，模型组大鼠大脑皮质M1和海马CA1区PSD-95蛋白的表达与空白组相比有显著性差异，表明模型组大鼠大脑皮质M1和海马CA1区PSD-95蛋白表达低于正常组。PSD-95蛋白可以决定突触的功能，其表达的减少可以影响自闭症模型大鼠脑内的突触，从而损害自闭症模型大鼠的学习记忆，这与我们课题组前期的研究结果一致。与模型组相比，针刺组大脑皮质M1区和海马CA1区PSD-95蛋白的表达差异显著(P < 0.05)，表明针刺后。
1.4指标检测:完成水迷宫试验后，立即麻醉4组大鼠，用手术刀切开胸部，充分暴露心脏，用耳科剪刀剪开右心耳，用5 m L注射针从左心室注入生理盐水250 m L，直至流出液清澈，然后连续注入4℃多聚甲醛500 m L。当大鼠四肢肌肉抽动时，灌注成功。快速切开头部，用镊子快速剥离脑组织，放入4%多聚甲醛中固定24小时。参照大鼠脑立体定向图谱实验结果如表1和表2所示。，取额极后2-5 mm和11-14 mm的脑切片进行脱水、浸蜡、包埋、切片、烘焙、烘烤、脱蜡等常规步骤。1 . 4 . 1 PSD-95蛋白免疫组织化学反应①柠檬酸修复:用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2 ~ 7.4)冲洗切片3次，每次3分钟；②用0.02 mol/L柠檬酸修复液高压修复3 min，自然冷却；③将载玻片依次放入湿盒中，滴加3% H2O2，室温静置10min④用0.01 mol/lpbs冲洗3次，每次3分钟；⑤将PSD-95一抗按1∶200稀释，将稀释后的液滴加到切片上，移入4℃冰箱中孵育12h；；⑥用0.01 mol/L PBS冲洗5min；每一次；⑦将SP-9001(二抗)滴入切片，37℃孵育2 h，用0.01 mol/L PBS冲洗3次。干燥，DAB显影，苏木精再染色，用中性胶密封。
1.4.2免疫组化评分采用BX51T-PHD-J11显微图像采集分析系统。在每只大鼠大脑皮层和海马的同一部位随机选取5个视野，用Image-ProPlus多功能真彩色细胞图像分析管理系统进行图像分析。
1.1主要仪器和试剂华佗一次性针灸针(苏州医疗用品厂有限公司，规格:0.30 mm×15mm，批号:120220)；HANS -200A韩国电针灸仪(南京济生医疗科技有限公司)；BX51T-PHD-J11显微镜，CMOS(日本奥林巴斯株式会社)；Image-ProPlus多功能真彩色细胞图像分析与管理系统(美国Media Cybernetics公司)；RM2015切片机(德国莱卡公司)；LDZ5-2离心机(北京离心机厂)；MIR-153烘箱和MDF-382E低温冰箱(日本三洋株式会社)；DSHZ-300恒温水浴箱(江苏省太仓医疗器械厂)；YWY781B医用微波炉(浙江临安爱迪仪器厂)；VPA(美国适马公司，浓度:250mg/ml)；抗PSD-95(北京博奥生物科技有限公司，BS-0179 r)；二抗SP-9001(美国invitrogen公司)；DAB(北京中山生物科技发展有限公司)。
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1.2实验动物分为成年Wistar大鼠10只，雌雄各半，由福建中医药大学实验动物中心提供。雌鼠体重200-250克，雄鼠体重300-350克。动物室温度应控制在18 ~ 26℃，光暗期为12h。将大鼠在动物室中饲养3天以适应环境。参照王月花等[3]的方法，将一公一母关一夜，第二天早晨，若在笼内或笼内检测到母鼠阴道栓剂，则记为胚胎第1天(E1)，单独关在笼内。E12.5注射600 mg/kg VPA后，通过发育行为评估，成功建立子代大鼠自闭症模型。实验选用18只幼鼠，分为模型组、非穴位组和针刺组，每组6只，另取6只正常生产幼鼠(不注射VPA，其余操作同)作为空白组。
针刺后海穴可以改善自闭症模型大鼠的学习记忆能力[1]，但针刺通过何种途径发挥作用尚不清楚。以往的研究认为，学习记忆与突触可塑性密切相关，针刺可以通过调节突触可塑性的变化来影响学习记忆能力。突触后密度蛋白95 (PSD-95)可与突触后谷氨酸受体相互作用，包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)与α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)受体相互作用，从而实现对突触后信号转导的调节。研究表明，PSD-95的表达一旦被抑制，就可以降低NMDA受体引起的兴奋毒性。然而，在PSD-95基因敲除小鼠中，AMPA受体介导的突触传递明显受到抑制[2]。从PSD-95蛋白入手，观察针刺后海穴对自闭症模型大鼠大脑皮质M1区和海马CA1区PSD-95蛋白表达的影响。
注:与空白组比较，1)P < 0.05；与模型组比较，2) P < 0.05。
1.3.1后海穴的选取参照实验针灸中的定位方法[4]，选取位于大鼠肛门与尾根之间的凹陷处的后海穴。非穴位组以右胁下固定的非经络非穴位为对照刺激点。
通信作者:吴强(1960—)，男，教授。电子邮件:[email & # 160；受保护]/* */
目的观察针刺后海穴对自闭症模型大鼠大脑皮质M1和海马CA1区PSD-95蛋白表达的影响。方法孕鼠腹腔注射丙戊酸钠(VPA)建立自闭症大鼠模型，分为空白组、模型组、非穴位组和针刺组，每组6只。A组针刺后海穴，用0.5寸一次性针灸针直刺0.3寸，1 min后拔针，10天为1个疗程，共3个疗程。非穴组选取大鼠固定右侧腹下非经络非穴位，其余操作同针刺组；空白组和模型组不进行任何干预；用免疫组织化学技术观察4组大鼠大脑皮质M1区和海马CA1区PSD-95蛋白的表达。结果与空白组相比，模型组大鼠大脑皮质M1区PSD-95蛋白表达差异有统计学意义(P < 0.05)。与模型组相比，针刺组PSD-95蛋白表达有显著差异。海马CA1区:与空白组相比，模型组PSD-95蛋白的表达有显著性差异(P < 0.05)；与模型组相比，针刺组PSD-95蛋白表达有显著差异。结论针刺后海穴可增加自闭症模型大鼠大脑皮质M1区和海马CA1区PSD-95蛋白的表达。
1.5统计数据用x±s表示，用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。差异有统计学意义(p < 0.05)。
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